應用凝膠成像分析系統定量測定 DNA含量的檢測范圍


                  1 引言
                   
                  凝膠成像系統圖像分析法是進行 DNA定量的一種重要手段。該方法主要根據熒光染料與 DNA結合,經過激發后得到熒光信號的強弱與 DNA含量有關,含量越高, 熒光信號越強, 并具有一定的比例關系。熒光信號強弱可以通過凝膠成像系統得到的凝膠圖片上的 DNA電泳條帶的灰度值來表示[ 1] 。根據這一特點,在知道已知含量 DNA灰度值的情況下,通過測定未知含量的灰度值, 即可得出樣本的 DNA含量。該方法由于操作簡便、直接、節省 DNA分子等特點,得到廣泛應用,特別是在進行少量 DNA的測定,

                  量 ,方法 1:DNA的含量 =(已知含量的 DNA的單位面積內的灰度值 )÷(D2000 6 μL上樣量 750 bp 處的 DNA的單位面積內的灰度值 )×D2000 6 μL上樣量 750 bp處的 DNA的含量;方法 2:根據已知D2000不同上樣量 750 bp處的 DNA含量與所對應電泳條帶平均灰度值建立的相關線性方程式 , 利用已知含量的 DNA所測定電泳條帶單位面積灰度值計算出 DNA含量。將這兩種計算所得的 DNA含量結果與已知 DNA含量做對比 ,觀察哪一種計算方法所得的 DNA含量更接近真實值。
                   
                  3 結果

                   
                  如對酶切產物的定量較為適用。由于灰度值的數量變化在 0 ~255之間,變化范圍較窄,因此需要尋找一個較佳的 DNA含量與灰度值具有相關性的范圍。在此范圍內,測定的灰度值應與 DNA的含量呈線性關系,且分辨率較高,使測定的 DNA含量更加準確。本研究擬對此 DNA檢測范圍進行探討。
                   
                  2 實驗材料和方法
                   
                  2.1 DNA電泳

                  3.1 不同組別不同含量 DNA的瓊脂糖凝膠電泳結果
                   
                   
                  結果見圖 1。
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                  圖 1A 組(1)電泳結果, 含量依次從低到高

                   
                  分成 3組進行 DNA電泳。 (1)取已知含量的質粒 DNA稀釋成 968 ng、726 ng、484 ng、242 ng、121 ng、60.5 ng、24.2 ng、12.1 ng, (2)將 D2000 marker (購自天佳公司 )以不同含量上樣, 為 1 μL、2 μL、3
                   
                  μL、4 μL、5 μL、6 μL、12 μL、18 μL。其中 750 bpDNA
                   
                  6 μL的含量為 100 ng。 (3)在同一塊瓊脂糖凝膠將
                   
                  D2000 marker以 2 μL、4 μL、6 μL、12 μL、上樣, 同時將已知含量 DNA稀釋成不同含量 (28 ng、56 ng、112 ng、140 ng上樣 )。上述 DNA行 1%瓊脂糖凝膠電泳 ,其中瓊脂糖內含有 0.5 μg/ml的溴化乙啶。
                   
                  2.2 DNA電泳結果的獲得與分析
                   
                  利用凝膠成像系統對 DNA瓊脂糖凝膠電泳結果進行觀察 ,并拍照。利用 ImageJ軟件對每條電泳條帶進行圖像分析[ 2] , 測定相同面積內 (每條帶測定的像素數一樣 )的平均灰度值。利用 Excel軟件對DNA含量和電泳條帶平均灰度值進行相關性分析 。
                    
                  圖 1B 組(2)電泳結果, 含量依次從低到高
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                  圖 1C 組(3)電泳結果, 含量依次從低到高
                   
                  圖 1  不同含量 DNA的瓊脂糖凝膠電泳的結果

                  266 中**體視學與圖像分析 2008年 第 13 卷 第 4 期
                   
                   
                  3.2 DNA含量與灰度值之間的線性關系分析結果
                   
                  對圖 1A、1B所得的每條電泳帶 ,根據測定的灰度值和相應的 DNA進行相關性分析 ,并求得線性方程。結果見圖 2。

                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                  圖 2A 圖 1A電泳結果的圖像獲得的各電泳帶的灰度值
                   
                  與 DNA含量的相關性分析
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                  圖 2B 圖 1A電泳結果的圖像 DNA含量為 484 ng、242ng、
                   
                  121ng、60.5 ng與相應各電泳帶的灰度值的相關性分析

                   
                   
                   
                   
                   
                   
                  圖 2D 圖 1B電泳結果圖像獲得的 3— 7電泳帶的 750 bp 處灰度值與相應 DNA含量的相關性分析
                  圖 2  DNA含量與灰度值之間的線性關系分析
                   
                   
                  3.3 未知 DNA含量的計算結果
                   
                  對圖 1C利用 1—3的電泳條帶的 750 bp的灰度值與已知 DNA含量之間建立的線性關系,根據這個線性關系,利用 5—8電泳條帶所得的灰度值計算出相應 DNA含量。結果顯示通過線性關系方程計算的DNA含量比直接針對某一已知 DNA含量的正比關系計算的 DNA含量更接近實際值。結果見圖 3及表 1。
                   
                  表 1 利用 DNA電泳條帶的灰度值計算 DNA 的含量與實際含量
                   
                  DNA含量(ng) 泳道 5 泳道 6 泳道 7 泳道 8
                           
                  方法 1 56.06 74.96 108.46 118.25
                  方法 2 30.30 61.53 113.80 123.58
                  實際值 28.00 56.00 112.00 140.00

                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                  圖 2C 圖 1B電泳結果的圖像獲得的各電泳帶的
                   
                  750bp處灰度值與相應 DNA含量的相關性分析

                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                  圖 3  圖 1C電泳結果的圖像獲得的 1— 3電泳帶的
                   
                  灰度值與 DNA含量的相關性分析
                   
                   
                  4 討論
                   
                  在一些分子生物學實驗過程中, 如質粒酶切, 基因片段與載體的連接、基因轉染等往往需要對操作的 DNA分子進行定量。 DNA分子定量方法很多 , 并在不斷發展中[ 3] 。其中建立在熒光 DNA分析基

                  2008 年 第 13卷 第 4 期 杜珍武等:應用凝膠成像分析系統定量測定 DNA含量的檢測范圍 267

                   
                  礎上的凝膠成像分析系統由于操作簡便、直接、節省DNA分子等特點,得到廣泛應用。
                   
                  利用凝膠成像系統進行 DNA含量測定 ,主要根據 DNA條帶灰度值與 DNA含量成一定的相關性。采用已知的 DNAMarker含量與相應的灰度值來估算在同一凝膠上的未知的 DNA含量[ 4] 。由于凝膠成像系統檢測的電泳條帶的灰度值在 0—255之間 , 當含量超過或低于一定含量時, 雖然含量相差很多 , 但相應的灰度值沒有顯著的差異, 使測定的 DNA含量與實際值相差很多。所以在進行 DNA定量時要求所測得的灰度值與相對應的 DNA含量處于一個高度分辨區。
                   
                  本研究通過對凝膠電泳圖像上的 DNA灰度值與 DNA含量的相關性分析結果表明:(1)DNA灰度值與 DNA含量呈正相關關系 , 但不成正比關系。(2)DNA灰度值與 DNA含量在一定范圍內呈現良好的線性關系。在圖 1A的電泳圖像 DNA含量為
                   
                  484 ng、242 ng、121 ng、60.5 ng時, 而在圖 1B的電泳圖像 DNA含量為 50ng、66.8 ng、83.5 ng、100ng、200 ng時, 與相應的灰度值可以建立良好線性關系 R2 為 0.9971。根據這種線性關系 , 可以判斷出同一凝膠電泳圖 DNA的檢測范圍。 (3)應用已知含量DNA灰度值與含量在一定范圍內呈現良好的線性關系可以較準確地計算出同一凝膠電泳圖譜上未知

                  DNA的含量 , 但需要未知含量 DNA的灰度值處于已知建立良好線性關系不同濃度 DNA相對應的灰度值之間。
                   
                  5 結論
                   
                  利用凝膠成像系統進行 DNA含量測定 ,需要明確測定的 DNA含量范圍, 在這一范圍內 DNA含量與灰度值成良好的線性關系。 通過對已知含量DNA灰度值與 DNA含量之間能夠建立良好線性關系的 DNA范圍的判定, 可以明確在同一凝膠圖像上未知含量 DNA的檢測范圍, 并根據建立的線性關系 ,計算出未知含量 DNA的含量。
                  精品H动漫无遮挡在线看中文