凝膠成像系統對核酸擴增產物的定量檢測

                  隨 著聚合酶鏈反應 P C R ) 的反應試劑 ,
                   
                  儀 器和操作的不斷發展和完善 , P C R 擴增產物的量化檢驗技術逐步趨向于 靈敏特 異 , 快
                   
                  速 **和 自動化.1[ 習 。     但由于定量 P C R 儀器
                   
                  昂貴 ,  成本較高 ,  操作難度大等原因 ,   尚未能
                   
                  普及 和 標準化 。 在常規的實 驗室 檢測 中 , 對 P C R 產物的分析 , 目前主 要還 是 以瓊脂糖電
                   
                  泳 ,  澳乙 睫 ( E B ) 染色 為主 。     其結果判斷主 觀
                   
                  性 強 ,  無法 量化檢測 ,  在一 定程度上限 制了
                   
                  P C R  技術在臨床檢驗上的應用 . 為此 ,  建立
                   
                  了一種在瓊脂糖電泳、  E B 染色的基礎上 ,  選
                   
                  擇**適 P C R 反應循環 次數 ,  并用 凝膠成 像分
                   
                  析 軟件進行分析定量的檢測方法 ,  現報告如
                   
                  下 :
                   
                  材 料和 方 法
                   
                  一、   檢測對象 :
                   
                  1. 標準 血清 :   H B V  陽性 血清經定值 標
                   
                  準品 標定并系列稀釋為 r 壬10 ~  1 0 6  拷貝 u/  l 。
                   
                  2 . 臨床檢測標本 : 均來自廣州 醫學院 第
                   
                  二 附屬 醫院傳染科 。
                   
                  二 、  儀器 :
                  1·     P C R 儀 :   P E 7 7 0 0  熒 定量分析儀 ,
                  P E 2 4 0 0 P C R  ( P e r k i n E lm e  r  , U S A ) 。
                   
                  2. 凝膠成像分析儀 :  U V I 圖 像分析儀
                  ( U V I一 P R O  , B r i t a i n  ) ,  分析軟 U V I p h o -

                  列為 :  5` 一 T G G C T A G T T T A C T A G T G C C A T
                   
                  T T G 一 3, 。 P C R 檢測試劑由中山 醫科大學達安公司提 供 , 批號 ” 0 7 70 。 按常規堿裂解法從血清中提 取 H B V 一 D N A , 擴增條件為 39 ℃ 2 分鐘預變性 , 93 ℃ 45 秒一 5 ℃ 21 0 秒 , 04
                   
                  個循環。
                   
                  2 . 定性 P C R  檢測及凝膠分析定量 :
                   
                  )1 檢測 原理 : 用 P C R 熒光定量分析儀實時監測 P C R 擴增曲線 , 并選擇合適 的擴增循環次數 : 終止 P C R 反應于 “ 平臺期效應  出現
                  前 ,  同時保證低濃度 模板有足 夠量的擴增產
                   
                  物 ,  以使凝 膠分析得 以 測出 ; 選擇凝膠分析軟
                   
                  件中能客觀反映核酸 實際含 量的**適 參數 ,
                   
                  制定標準曲線 。
                   
                  2) 方法 :  標本處理 、  引物 及擴增條件同定
                   
                  量 P C R 。  循環次數分別選擇 04  ,   53  ,  及 23  次。
                   
                  準確吸取擴 增產物 s  lu  進行常規瓊脂糖電
                   
                  泳 ,  E B 染色 。電泳后將凝膠置于 U V I 暗箱
                   
                  中 ,  用U V l p h o  t o   軟件攝像 ,  用 U V I  b a  n d  
                   
                  的光密度定量軟件分析 圖像。 選擇所需分析條帶 , 去除噪 音 ( 干擾 ) , 確定** 適 閡值 , 檢測
                   
                  標準梯 度血清擴增條帶的體積 ,  面積 ,   高度 ,
                   
                  位置及 體積百分 比等 , 得出標準曲線 , 梯度濃度直方圖及相關系數。 用該標準曲線定量待
                   
                  測標本 ,    電腦 打 印實驗結 果 ,   同時與 定量
                   
                  P C R 結果對 照 。

                  t o 及 U V l b a n d 。
                   
                  三、  檢測方法 :
                   
                  1. 定量 P C R  檢測 川 : 采用 實時 F Q -
                   
                  P C R , 連續檢測反應體系中熒光信號 變化 。 以起始模板拷 員數的 自然對 數為橫坐 標 , 以循
                   
                  環閉值為縱坐標 , 用陽性梯度標準品制定標準曲線 , 相關系數 r > 0 . 89 , 計算標本中起始
                  D N A  。 引物序列為 :  P l :  5 ,  一 A T C C T G C T G
                   
                  C T A T G C C T C A T C T T 一 3` , P Z : 5` 一 A C A G T G G G G G A A A G C C C T A C G A A 一 3` ; 熒光探針 序
                   

                  結 果
                   
                  一 、   梯度標準血清的 P C R實時熒光檢測
                   
                  的擴增 曲線 :
                   
                  用 實時熒光定量 P C R  連續五次檢測梯
                   
                  度 標準血清 ( 1 10 ~  l 護 拷 貝 / lu  ) ,  根據梯度血
                   
                  清熒光信號到達循環闌值時的擴增次數及到
                   
                  達平臺期的擴增次數 ( 表 1 ) , 選擇 P C R 一 凝膠分析定量法 的 P C R 擴增次 數分別為 40 , 35
                  及 3 2 次。

                                  《上海生 物醫學工程 》雜志 2 0 0 0 年第 2   卷第 4  期                          
                          熒光 實時   檢測標準血清   拷貝/u  ) 與 l   次數的關系 ` 士s            
                                    P C   R                 (           P C   R                     )          
                        循環次教   檢測 例次                             D N A  含量( 拷貝/ 、 . )                            
                                0           0 2         0         0 盈           0 5           0 6      
                                                                                               
                  達悶值之 循環次數         2   7 0   7 2   0  6 2 7   土 8  5 2 5   0     2 2   Q     0 0   2
                                                          0                          
                                        .     .     .       .   .   .     .     .     .     .   .       .  
                  達平臺期之 循環次數         4  7 士 0 .     5 士 0 . 2   士 0 6   0 . 7 土 0     2 7   0 士 0  72   7 士 0   2
                                          .       .       .   .               .     .   .       .  
                      二、   不同循環次數凝膠圖像分析結果           次循環時 ,   01   拷貝 / lu 時用瓊脂 糖電泳 ,   E B
                        .**適循環次數的選擇 將梯度標準血       染色及聚丙酞胺 電泳 ,  硝酸銀染色均未能檢
                    ( 0 ` 0 `   u )   l       4 0 , 3 5   3 2     ,                   ,                        
                                                                                 
                      拷貝/                             出 說明其產物量過低 低于銀染檢測的靈敏
                            分別進 行                  
                  次循 環次數的擴增 ,  在瓊脂糖 電泳 , E B  染色       度。   1 0 2 ~  1 0 6 拷貝 / 。 l 的 5 個梯度的模板 ( 對
                  后 ,  進行凝膠分析。 結果發現 : 04   及 53 次循     數值 ) 與產物 ( 體積 ) 有良好的線性關系 r(  -
                  環時 , 在起始模板考貝數較低時 ( 1 10 一 01 `       0 .     9 7 ) 。  為 23   次循環線性范圍較廣 ,   為**適
                  貝 / Iu ) ,  線 性 良好 , 而在 01 `  ,   150      1。` 拷貝 /     循環次數 ( 圖 ) 。                                  
                  ul  三 個梯度時直線 上 升緩慢 , 趨于 平坦 ;  32                                                      
                   
                  1 4 0 00 0
                   
                  1 20 0 00
                   
                  1 00 0 00
                   
                  伽呆 8 0 0D0 A ( Lo  g )
                   
                  6 0 00 0
                   
                  4 0 0 0 0  
                  2 00 0 0  
                   
                   
                   
                  圖 一H B V D N A  含量與光密 度體積的關系
                   
                    2 .   靈敏度和線性 范圍 :   04 及 53  次循環   表 2 D N A 含量與光密度的關系      
                  時 ,  **低可檢出 01  拷貝 / lu 起始模板量 ,   其 D N A        ( 3 2  e y e l e 。  )        
                  線性范圍為 110  ~  1 少 拷貝 / uI  ; 23  次循環時 , 討考貝數加 體積 高度 面積 % 體積
                  線性范圍為 1以~  1護 拷貝 / lt , 線性范圍廣 , 1 0 1 1 8 3 0 5 1 3 7   0   15
                      1 0 : 7 6 2 3 1 2 5 1 5   0   6 4
                  適合臨床 需要                  
                  。           1 0 3 2 2 5 5 8 4 6 8 3 3   1 . 9 0
                    3 .   凝膠分析軟 件定量指標的選擇 在 1 0 . 峨7 4 1 3 1 1 9 82 3   4   0 0
                                      :                 .  
                            .       ,       1 0 5 8 5 2 3 6 1 6 3 9 4 8   7 . 19
                  U V I  b a  n d 的光密度定 量分 析指標 中 以體 1 0 ` 1 1 6 7 1 6 1 6 8 1 0 0 0   9 . 8 5
                                                 
                  積或體積百 分比作為定 量指 標較 好 ,  面 積及                    
                  高度等與起 始模板無 明顯 相關性 ( 表 2 ) 。                    
                    、 凝膠定量分析與熒光定量 P C R 結果                
                                         
                  比較 :                   一、   **適循環次數的選擇 :          
                  測標本同時進行 P C R 一 凝膠定量分          
                    P C R  反應中 , 隨著擴增反應的不斷進
                  析及熒 定量 P C R 分析 ,  結果有良好的一致
                  行 ,   目的模板拷貝數以 指數的形式迅速遞增。
                  。                  
                                          但是 ,   當反應體 系中引物一 模板與 T l(a     酶 -

                  《上海生 物醫學工程》雜志 2 年第 2 盆卷第 4 期

                   
                  M g Z 十 的 比例達到一定程 度時 ,  酶的催化反應
                   
                  趨 于飽和 ,  此時所擴增 D N A  片段的增 加進
                   
                  入 相對穩定狀態 , 即 出現 所謂的 平 臺期效應 ” , 將不利于以后 的產物檢測 , 其產物的生
                   
                  成量的模板量不呈一 定的相關性 。  因此 ,  有必
                   
                  要對 P C R 的循環次數進行系統分析 , 以選出**適擴增循環次數’.[  ] 。
                   
                  本方法 是將定量標準血清與待測樣本同時裂解處理 , 擴增后經 常規瓊脂糖 電泳 , E B
                   
                  染色后 , 進行凝膠圖像分析 , 根據其光密度體積制定標準曲線。 在實驗中既要避免 P C R 反應進入平臺期 , 同時又 需保證低濃度模板得
                   
                  到 足夠量的擴增產物 ,  以使凝膠圖像分析系
                   
                  統 能夠 檢測并進行分析 。 本實 驗通過實時監測 P C R 擴增曲線 , 找出不同拷 貝模板量開始擴增的循 環次數及到達 平臺期的循 環次數 ,
                   
                  并根據凝膠染色所能檢測 的靈敏度選擇 了 23 個循環 。 結果證 明擴增產物 與起始模板 量
                   
                  相關性良好 ,  且 有較廣 的測定范 圍 ,  有一定的
                   
                  通用性 ,  并在丙型該 眼肝炎 ( H C V 一 R N A ) 和
                   
                  結核 ( T B一 D N A ) 的 P C R 中獲得類似結果 。二、 凝膠圖像分析指標的選擇 :
                   
                  圖像分析中的光密度測定是基于對圖像象素的數字化處理 , 所選條帶的光密度定量
                  資料根 據其體積進 行計算。     條帶定 量依賴于
                   
                  所選 區域的 象素量 及測定 點的密度 ,  結果 以
                   
                  光密度總量 (體積 ) 表示 。 在凝膠圖像分析軟件中 , 光 密度定量分析的指 標有 體積 , 面 積 , 高度 , 體積百分 比及分子量等。 體積或體積百分比是 所定義體積 區域內的光密度總量 或總
                   
                  量百 分比 , 面積則指所定義 區域內 每個峰值的面積 , 高度是在 0 ~ 25 5 灰度范圍中的**大光密度量 。 實驗結果表明 , 體積及體積百分比與梯度起始模板有 良好的相關關 系 , 能客觀
                   
                  反映凝膠中的 D N A  含量 ,  是 一個較好的定
                   
                  量指標 ;  由于瓊脂糖電泳后的 P C R 產物是立
                   
                  體存在于 凝膠中 ,  顯然用面 積或 高度不能真
                   
                  實反映 D N A 含量 ; 分子 量對電泳位置有一定意義 , 在有 M a r ek r 及陽 性對照情況下 , 有
                   

                  助于排除非特異性條帶[j6 。三、 方法學評價 :
                  選 擇合適的 P C R  循環次數一 常規瓊脂
                   
                  糖 電泳 ,  E B 染色 ~ 凝膠圖像光密度分析~ 定
                   
                  量檢測等 系列工作表明該法有以下特點 :   1.
                   
                  操作簡便 , 快速 。 除常規 P C R 外 , 僅需用 軟件定量核酸 , 2 . 結果判斷客觀 , 可去除干擾和
                   
                  非特異性條帶 ;  3 .        保護 操作者。     操作過 程 中
                   
                  操作者不與紫外線直接接觸 ;  4.        結果可 長期
                   
                  保存備查 ,  為臨床結果 的前后對 比 及科研資
                   
                  料 的積累提供便利的工具 ; 5 .       除對常規 P C R
                   
                  產 物定量 ( H B V  D N A ,  T B一 D N A ) ,  也適用于
                   
                  R T 一 P C R ( H C V  R N A ) 。
                   
                  本法屬 外參照定 量 P C R , 在每次檢測 均應設置標準品 ; 不同廠家及不同批號的試劑 ,
                   
                  因其擴增效率可能有差異 , 應調整 P C R 循環次數 ; 瓊脂 糖電泳時應嚴 格取量 , 以 減少誤
                   
                  。
                   
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