固相萃取-超高效液相色譜分離測定洗滌用品中4種熒光增白劑

                  熒 光 增 白 劑 ( fluorescent whitening agents, FWA) 可以提高基體的白度和保證基體的亮度,在
                  洗滌用品、紡織品、紙張、涂料和塑料制品中的應用越來越廣泛。紡織品在使用過程中會逐漸變黃,而洗滌劑中的熒光增白劑在洗滌過程中吸附在織物纖維上,吸收紫外光后,發射出的藍紫色熒光補償了纖維的黃色光,在視覺上認為被洗滌的白色織物潔白、明亮,從而會認為含熒光增白劑的洗滌劑具有更好的洗滌效果。我**允許在衣物洗滌劑中添加二苯乙烯基聯苯類( 如 4,4'-雙 ( 2-磺酸鈉苯乙烯基) 聯苯 ( disodium 4,4'-bis ( 2-sulfonatostyryl ) biphenyl, FWA351) 等) 和雙三嗪氨基二苯乙烯類( 如 4,4'-雙[( 4-苯胺基-6-羥乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基) 氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉鹽 ( disodium 4,4'-bis
                   
                  [( 4-anilino-6-hydroxyethylami**,3,5-triazin-2-yl ) amino]stilbene-2,2'-disulphonate,FWA85) 、4,4'-雙
                   
                  [( 6-苯胺基-4,4'-二羥乙基-氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉鹽( disodium 4,4'-bis[6-anilino-[4-[bis( 2-hydroxyethyl) amino]-1,3,5-triazin-2-yl ] amino ] stilbene-2, 2'-disulphonate, FWA28) 、4,4'-雙[( 4-苯胺基-6-嗎啉基-1,3,5-三嗪-2-基) 氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二鈉鹽( disodium 4,4'-bis[( 4-anilino-6-morpholi**,3,5-triazin-2-yl)
                  amino]stilbene-2,2'-disulphonate,FWA71) 等) 熒光 增白劑,但沒有規定**大使用量,也沒有相關檢測方   法。雖然有資料表明這兩類熒光增白劑是低毒 [1,2] ,但也可能因其大量的使用而產生環境污染 的           [3 - 12] ,因此,為了維護消費者權益、監管 和人體危害   洗滌用品質量和評估環境影響,有必要建立洗滌用 品中熒光增白劑的定性定量檢測方法。     **內外關于熒光增白劑的檢測方法主要有紫外       [13]     [3] 、液相色譜 燈照射觀測法   、熒光分光光度法   [4 - 9]       [10 - 12] 。紫外燈照射 法     和液相色譜-串聯質譜法   觀測法只能檢測樣品中熒光增白劑的總量,不能鑒 定熒光增白劑的品種; 液相色譜法和液相色譜-串聯 質譜法均可應用于熒光增白劑的定性和定量檢測, 由于熒光增白劑的含量高,液相色譜法應用更廣泛。 文獻報道多采用離子對試劑進行色譜分離和熒光檢           [6,7] 應用離子對試劑( tetrabutyl- 測器檢測,如 Shu 等   ammonium hydrogen sulfate,TBA) -液相色譜 / 熒光檢 測器檢測洗滌劑和地表水、嬰幼兒紡織品和紙張中 87%) 和 FWA71 ( 純度約為 97%) 由 International
                  laboratory ( U. S. A) 提供; 其中 FWA28、FWA85 和
                  的 5 種熒光增白劑,其中包括 FWA28、FWA351 和
                  ; [10,11] (
                  FWA71 Chen 等 應用離子對試劑 di-n-hexyl-ammonium acetate,DHAA) -液相色譜 / 質譜實現環境水、嬰幼兒紡織品和紙張中 5 種熒光增白劑的分離和檢測,其中也包括了 FWA28、FWA351 和 FWA71; 練習中等8應用離子對試劑( TBA) -液相色譜 / 熒光檢測器檢測了食品中的熒光增白劑 ( 包括
                   
                  FWA87、FWA251 和 FWA71) ; 鄧凱芬等9應用液相色譜 / 熒光檢測器檢測紙塑包裝中熒光增白劑
                   
                  FWA85。但離子對試劑可與固定相結合產生不可逆吸附,較難從色譜柱上洗脫,縮短了色譜柱的使用壽命; 而且熒光增白劑易受溶劑極性、溶液 pH、光照等因素的影響轉變為順式異構體,熒光消失,導致熒光檢測器檢測不出順式結構,只能檢測反式異構
                   
                  [3,14 - 16]
                  體 。
                   
                  本文利用超高效液相色譜-二極管陣列檢測器 ( UPLC-DAD) 對洗滌用品中 4 種熒光增白劑( 結構式見圖 1) 進行定性和定量研究,并借助超高效液相色譜-質譜 / 質譜( UPLC-MS /MS) 對待測物進行定性確證,表明了 UPLC-DAD 可以實現 4 種熒光增白劑的順式和反式異構體的良好分離和準確檢測,檢測結果更能反映樣品中待測物的含量情況,可更好地為相關企業和有關監管部門提供檢測技術支持。

                  1  實驗部分    
                       
                           
                  1. 1  儀器、試劑與材料    
                  Acquity TM 超高效液相色譜儀,配光電二極管陣
                       
                  列檢測器 ( UPLC-PAD,Waters 公司) ;  Acquity TM
                       
                  高效液相色譜和 Waters XevoTM  TQ MS 三重四極桿
                  串聯質譜儀( UPLC-MS /MS,Waters 公司) ;  LD5-2A
                  離心機( 北京京立離心機有限公司) ;  MS3 basic 漩
                  渦混合器( 德** IKA 公司) ;  KQ-250DV 型數控超聲
                   
                  波清洗儀( 昆山市超聲儀器有限公司) ;  Milli-Q 去
                   
                  離子水發生器( 美** Millipore 公司) ; 固相萃取裝置
                  ( Waters 公司) ; Waters Oasis WAX 固相萃取小柱: 3
                  mL /60 mg,30 μm,臨用前依次用 3 mL 甲醇和 3 mL
                  水活化。        
                  4 種待測化合物對照品 / 參照品: FWA351( 純度
                  > 98. 0%) 由 TCI( 梯希愛) 公司提供; FWA28 ( 純度
                   
                  約為76 %) 由 Sigma 公司提供 ; FWA85 ( 純度約為
                           
                  FWA71 的純度是通過液相色譜分離后,以歸一法計算得到。甲醇和乙腈( HPLC 級,德** Merck 公司) 

                  乙酸銨 ( HPLC 級,Sigma 公司 ) ,甲酸 ( HPLC 級,
                   
                  CNW 公司) ,氨水( AR,含量為 25%,廣州) ,超純水 ( 18. 2 MΩ·cm) 。10 個洗衣液樣品、5 個洗衣粉樣品均購于本地市場。
                  1. 2 標準溶液的配制
                   
                  稱取各熒光增白劑對照品 / 參照品,用甲醇配制成質量濃度( 按相應純度折算) 為 5 000 mg /L 的標準貯備液。分別準確移取適量的標準貯備液于 25 mL 棕色容量瓶中,以水配成 FWA28、FWA85 和 FWA71 質量濃度均為 300 mg /L、FWA351 質量濃度為 50 mg /L 的混合標準溶液。以水稀釋成 7 個濃度水平的混合標準工作液: FWA28、FWA85 和 FWA71
                   
                  的質量濃度為 0. 3、0. 6、1. 8、9、45、90、180 mg /L;
                   
                  FWA351 的質量濃度為 0. 05、0. 1、0. 3、1. 5、7. 5、15、 30 mg /L。
                   
                  1. 3 儀器條件
                   
                  1. 3. 1 UPLC-PAD 檢測條件
                   
                  色譜柱: Phenomenex Synergi Max-RP 柱 ( 150 mm × 2. 0 mm,4 μm,孔徑 8 nm) ; 流動相: A. 10 mmol /L 乙酸銨,B. 乙腈。梯度洗脫程序: 0. 0 ~ 8. 0 min,80% A ~ 72% A; 8. 0 ~ 13. 0 min,72% A ~ 62% A; 13. 0 ~ 15. 0 min,62% A ~ 20% A; 15. 0 ~ 18. 0
                   
                  min,20% A;  18. 0 ~ 18. 1 min,20% A ~ 80% A;
                   
                  18. 1 ~ 22. 0 min,80% A。流速: 0. 5 mL /min; 進樣
                  量: 5 μL; 柱溫: 25 ℃ ; 檢測波長: 350 nm。
                  1. 3. 2 UPLC-MS /MS 檢測條件
                   

                  色譜條件同 1. 3. 1 節。
                   
                  質譜條件: 電噴霧離子源( ESI) ,負離子掃描模式,毛細管電壓 1. 0 kV; 離子源溫度 150 ℃ ; 去溶劑氣溫度 500 ℃ ; 去溶劑氣: 氮氣,800 L /h; 錐孔氣: 氮氣,50 L /h; 碰撞氣: 高純氬氣,0. 2 mL /min; 檢測模式: 多反應監測( MRM) 模式; 4 種化合物均選擇響
                  2 -
                  應**高的[M - 2Na] 為母離子,各監測離子對 ( m /z) 及錐孔電壓、碰撞能等參數見表 1,每個離子對的駐留時間均為 0. 04 s。
                   
                    表 1 4 種待測物的質譜分析條件  
                    Table 1  MS parameters for the analysis of the  
                      four compounds    
                           
                  Compound Precursor Daughter Cone Collision
                  ion ( m /z) ion ( m /z) voltage /V energy /eV
                   
                             
                  FWA85 413. 3 311 . 0* 40 25
                        271 . 2 40 25
                  FWA28 457. 3 333 . 2* 45 25
                        293 . 1 45 30
                  FWA351 258. 2 226 . 2* 35 20
                        194 . 1 35 22
                  FWA71 439. 3 284 . 3* 40 30
                        324 . 2 40 25
                               
                   
                  * Transitions for quantification.
                   
                  1. 4 樣品的處理
                   
                  稱取 0. 5 g( **** 0. 001 g) 試樣于 10 mL 具塞比色管中,加入 5 mL 2% ( 體積分數) 甲酸水溶液,渦旋、超聲溶解后,用甲醇定容,混勻,以 2 500 r /min 離心 5 min,待凈化。
                   
                  吸取 1. 0 mL 提取清液于已活化的 WAX 固相
                   

                  萃取小柱中,自然流出后,依次用 5 mL 25 mmol /L
                   
                  乙酸銨溶液( pH 4) 、3 mL 甲醇淋洗,用 5 mL 5% 氨
                   
                  化甲醇洗脫,接收洗脫液,于 40 ℃ 水浴中氮吹濃縮**干,用 50% ( 體積分數) 甲醇水溶液定容** 1. 0 mL,經聚四氟乙烯( PTFE) 濾膜過濾后測定。
                   
                  2 結果與討論
                   
                  2. 1  熒光增白劑對照品 / 參照品存在的問題
                   
                  所研究的 4 種待測物均屬于二苯乙烯型熒光增白劑,有順式和反式兩種異構體。反式異構體在
                   
                  270 nm 和 349 nm 有明顯吸收,其中 349 nm 對應于二苯乙烯分子的共軛體系,270 nm 處是苯胺基團的吸收峰,而順式異構體在 270 nm 處呈現明顯的吸收
                   
                  [14 - 16] 。
                  峰,349 nm 處的吸收強度減弱并發生藍移
                  FWA351 沒有苯胺基團,故只有明顯的 349 nm 吸收峰,其順式異構體的紫外吸收藍移** 340 nm。
                   
                  由于目前還無法買到純度高的熒光增白劑標準品,本實驗根據液相色譜條件和對應色譜峰的光譜圖,結合 UPLC-MS /MS 分析,確定待測物及其順式和反式異構體,并以歸一化法計算相應參照品的純度,以每種待測物的順式和反式異構體的 2 個色譜
                  2. 2  色譜分析條件的優化   KH2 PO4 溶液兩種水相對待測物色譜行為的影響。
                    對比了 4 根不同的反相色譜柱: 柱 1 為三鍵鍵 試驗發現: 乙腈比甲醇具有更好的洗脫能力和分離
                    合的 Waters Acquity UPLC BEH C18 ( 100 mm × 2. 1 效果; 使用 10 mmol /L KH2 PO4  的保留時間比 10
                    mm,1. 7 μm) ; 柱 2 為單鍵鍵合 C18、內嵌極性酰胺 mmol /L 乙酸銨的保留時間延長,FWA351 的峰形稍
                    基團、TMS ( 三甲基硅烷基) 封端的 Waters Acquity 呈拖尾 ( 見圖 5 ) 。因此,本實驗選用乙腈-10
                    UPLC BEH Shield RP18 ( 50 mm × 2. 1 mm,1. 7 mmol /L 乙酸銨為流動相,采用梯度洗脫,液相色譜
                    μm) ; 柱 3 為單鍵鍵合 C18、TMS 封端的 Phenomenex 圖見圖 2。    
                    Luna C18 ( 2) ( 150 mm × 2. 00 mm,3 μm,孔徑 10      
                   
                  nm) ; 柱 4 為單鍵鍵合 C12、TMS 封端的 Phenomenex Synergi Max-RP( 150 mm × 2. 00 mm,4 μm,孔徑 8 nm) 色譜柱。不同色譜柱的分析譜圖見圖 4。

                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                  圖 4  不同色譜柱對 4 種熒光增白劑的分離色譜圖的對比
                   
                  Fig. 4 Comparison of chromatograms of the four FWAs on different columns
                   
                  a. Waters Acquity UPLC BEH C18 ( 100 mm × 2. 1 mm,1. 7 μm) ,acetonitrile-3% TBA( pH 8) as mobile phase; b. Waters Ac-quity UPLC BEH C18 ( 100 mm × 2. 1 mm,1. 7 μm) ; c. Waters Ac-quity UPLC BEH Shield RP18 ( 50 mm × 2. 1 mm,1. 7 μm) ; d. Phenomenex Luna C18( 2) ( 150 mm × 2. 00 mm,3 μm) ; e. Phe-nomenex Synergi Max-RP ( 150 mm × 2. 00 mm,4 μm ) . Mobile phase of b,c,d,e was acetonitrile-10 mmol /L ammonium acetate.
                   
                  The peaks are the same as in Fig. 2.
                   
                  在 4 根色譜柱中,由于 4 種熒光增白劑在水溶液中以陰離子的形式存在,以水作為流動相的水相時,由于待測物的大分子結構的空間位阻在反相色譜柱上呈現弱保留,無法完全分離; 使用陽離子型離
                   
                  子對試劑 TBA 時,增強了待測物與固定相的結合能力,可以較好地分離,但 FWA71 反式異構體的響應很低; 使用 10 mmol /L 乙酸銨-乙腈為流動相時,均可實現分離,但柱 1 的色譜峰頂部分叉,峰形**差,
                   
                  柱 2 和柱 3 的峰形前伸,而柱 4 的峰形**佳,分離度**好。因此,本實驗確定選用柱 4( Phenomenex Syn-ergi Max-RP 色譜柱) ,并初步選用乙酸銨或其他鹽溶液為流動相的水相。
                   
                  在 Synergi Max-RP 色譜柱上進一步比較了甲醇和乙腈兩種有機相、10 mmol /L 乙酸銨和 10 mmol /L
                   

                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                   
                  圖 5 使用不同流動相時 4 種熒光增白劑在 Synergi Max-RP 色譜柱上的色譜圖對比
                   
                  Fig. 5 Comparison of chromatograms of the four FWAs on Synergi Max-RP column with
                   
                  different mobile phases
                   
                  a. methanol-10 mmol /L ammonium acetate; b. acetonitrile-10 mmol /L ammonium acetate; c. acetonitrile-10 mmol /L KH2 PO4 .
                   
                  The peaks are the same as in Fig. 2.
                   
                  2. 3 前處理凈化條件的優化
                   
                  考察了 HLB( Waters,3 mL /60 mg) 、MAX( Wa-ters,3 mL /60 mg) 、WAX( Waters,3 mL /60 mg) 和
                   
                  NH2 ( Phenomenex,3 mL /500 mg) 4 種固相萃取柱對
                   
                  待測物的凈化回收效果,結果見表 2。
                   
                  4 種待測物均含有磺酸基( -SO3 ) ,酸性強( pKa
                   
                  < 1) ,親水性強。MAX 固相萃取小柱屬于混合型強陰離子交換柱,待測物的磺酸基與柱上的季銨陽離
                   
                  子結合,難以洗脫; HLB 固相萃取小柱屬于親水、親酯的通用型固相萃取柱,待測物難以與親水性和親
                   
                  脂性吸附點緊密結合,凈化效果較差; WAX 固相萃取小柱屬于混合型弱陰離子交換柱,柱上的哌嗪環與待測物形成離子型吸附,用甲醇淋洗,可有效去除有機雜質,凈化效果和回收率良好; NH2 固相萃取小
                   
                  柱上的脂肪族氨丙基在一定 pH 條件下對水溶液中的陰離子選擇性吸附,但由于這種伯胺基團的 pKa 大約為 9. 8,需要使用堿性較強的洗脫液 ( pKa ≥ 11. 8) ,使用 12% 氨水甲醇作為洗脫液,氮吹耗時較長,回收不理想,且過柱速度較慢。因此,本實驗選用 WAX 固相萃取柱對洗滌用品中的熒光增白劑進
                    
                  行凈化處理。
                   
                  表 2 4 種固相萃取小柱對待測物的凈化回收率和相對標準偏差( RSD) ( n = 3)
                   
                  Table 2 Purification recoveries and relative standard deviations ( RSDs) of the analytes by four
                    SPE columns ( n = 3)       %
                               
                  Analyte       Recovery ( RSD)    
                                 
                    HLB MAX WAX NH2
                     
                  FWA351 62 . 3 ( 11. 2) 0 101 ( 2. 6) 81. 7 ( 9. 1)
                  FWA85 64 . 4 ( 12. 7) 0 92. 6 ( 4. 3) 89. 5 ( 7. 5)
                  FWA28 78 . 4 ( 7. 0) 0 94. 9 ( 3. 7) 85. 5 ( 4. 8)
                  FWA71 78 . 8 ( 8. 4) 0 93. 1 ( 3. 2) 78. 3 ( 5. 9)
                                   
                   
                  由于洗衣粉一般呈弱堿性,為了使 WAX 小柱更好地吸附待測物,故選用 2% 甲酸水溶液溶解樣品,使樣品溶液呈弱酸性,并以甲醇消除洗衣粉溶解時產生的泡沫。
                  2. 4 線性關系、檢出限和定量限
                   
                  按 1. 3. 1 節方法測定 1. 2 節所述的待測物標準溶液系列。FWA351 在 0. 05 ~ 30 mg /L 范圍內、
                   
                  FWA85 和 FWA28 在 0. 3 ~ 180  mg /L 范圍內、
                   
                  FWA71 在 0. 6 ~ 180 mg /L 范圍內與峰面積呈線性關系。各種待測物的線性回歸方程、相關系數( r) 、儀器檢出限( ILOD,S /N = 3,以純標準溶液測定) 及方法定量限( MLOQ,S /N = 10,通過在樣品基質中加入標準溶液進行前處理后測定,結合樣品稱樣量和稀釋倍數計算出來) 見表 3。由表 3 可知: 4 種待測物在各自的線性范圍內線性關系良好,相關系數均大于 0. 999; ILOD 為 0. 02 ~ 0. 2 mg /L; MLOQ 為
                   
                  1. 5 ~ 15 mg /kg。
                   
                  表 3 待測物的線性方程、相關系數、儀器檢出限和方法定量限
                   
                  Table 3 Regression equations,correlation coefficients ( r) ,the instrument limits of detection ( IL-OD) and the method limit of quantification ( MLOQ) of the analytes
                   
                  Analyte Regression equation r ILOD / MLOQ /
                  ( mg /L) ( mg /kg)
                       
                               
                  FWA351 y = 62595x + 995. 14 0. 9997 0 . 02 1 . 5
                  FWA85 y = 12071x + 1641. 1 0. 9993 0 . 1 8  
                  FWA28 y = 12406x + 937. 53 0. 9994 0 . 1 8  
                  FWA71 y = 8236. 6x + 525. 38 0. 9993 0 . 2 15  
                               
                   
                  y: peak area; x: mass concentration,mg /L.
                   
                  2. 5 方法回收率與精密度
                   
                  選取不含待測物的陰性洗衣液和洗衣粉樣品進行加標回收試驗,6 次平行測定的回收試驗結果見表 4。不同樣品在添加濃度范圍內,FWA351、FWA85、FWA28 和 FWA71 的回收率分別為 92. 5%
                   
                  ~ 103%、86. 9% ~ 95. 3%、92. 5% ~ 105% 和 84. 9% ~101%,RSD 為 3. 2% ~ 6. 1%。

                   
                      表 4 回收率和精密度測定結果( n = 6)      
                    Table 4 Determination results of recovery and    
                        precision ( n = 6)            
                                 
                      Spiked / Liquid laundry Powder laundry
                    Analyte   detergent       detergent
                    ( mg /kg)          
                                       
                        Recovery /% RSD /% Recovery /% RSD /%
                           
                                         
                  FWA351 5     97 . 4 3. 9 93 . 7 4. 5
                      25     98. 8 4. 1 95. 9 4. 3
                      250     103   3. 2 92 . 5 3. 6
                  FWA85 30     86 . 9 5. 1 91 . 3 4. 9
                      150     95 . 3 4. 7 94 . 1 5. 2
                      1500     92 . 1 4. 3 89 . 4 5. 9
                  FWA28 30     92 . 5 4. 2 95 . 1 5. 3
                      150     96 . 1 4. 9 93 . 8 4. 5
                      1500     98 . 6 4. 4 105   6. 1
                  FWA71 30     89 . 7 4. 9 84 . 9 5. 5
                      150     93 . 4 4. 5 91 . 7 4. 3
                      1500     101   3. 5 96 . 2 4. 8
                      表 5 15 份樣品中 4 種熒光增白劑的含量    
                    Table 5 Contents of the four fluorescent whitening    
                        agents in 15 samples     mg /kg
                                 
                    Sample   No. FWA351 FWA85 FWA28 FWA71
                                       
                    Liquid   1*   644. 3 400. 6   10.
                    detergent   2       4
                        3     90. 2  
                        4   582. 7  
                           
                        5      
                             
                        6      
                             
                        7   1083  
                           
                        8      
                             
                        9      
                             
                      10      
                           
                    Powder 11     83. 4 24. 1  
                          1544
                    detergent 12     19. 0 539. 3 15. 6 19.
                      13     22. 1   5
                      14     46. 5   2. 7
                      15      
                             
                    *  Baby use; - : not detected.          
                               
                   
                  2. 6 實際樣品的檢測
                   
                  使用本方法測定了本地市場上購買的 10 個洗衣液樣品和 5 個洗衣粉樣品,檢測結果見表 5。表 5
                   
                  的數據表明: 15 個樣品中,檢出陽性樣品 8 個,陽性樣品檢出率為 53. 3%; 4 種待測物中,FWA351 的檢出率**高,為 53. 3%,含量范圍為 22. 1 ~ 1 083 mg /kg,表明洗滌用品中較多使用該種熒光增白劑;在樣品( 洗衣粉) 12 中,同時檢出了 4 種目標物,其液相色譜圖見圖 6,采用液相色譜-質譜按 1. 3. 2 節
                   
                  方法確證的提取離子色譜圖見圖 7。
                   
                  3 結論
                   
                  建立了同時測定洗滌用品中 4 種熒光增白劑 ( FWA85、FWA28、FWA351 和 FWA71 ) 的超高效液相色譜-二極管陣列檢測方法。洗衣液和洗衣粉樣品中的陰離子型熒光增白劑通過 2% 甲酸水溶液溶解,甲醇提取,WAX 固相萃取小柱凈化,獲得較好的
                   

                  .
                  .凈化效果; 采用 Synergi Max-RP 色譜柱,以乙腈-10 mmol /L 乙酸銨進行梯度洗脫,獲得良好的分離度 ( 包括順式和反式異構體) ,根據保留時間和光譜圖定性,標準工作曲線定量。通過對方法回收率、精密
                   

                  度等方法學技術指標的研究,表明方法具有較高的回收率和精密度,且方法的前處理簡單,可為定性和定量分析洗滌用品中熒光增白劑( 包括順式和反式異構體) 提供一種準確有效的檢測方法。
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